高大上的 QPCR 实时荧光定量 Easyinno 式快速进阶

目前随着新冠病毒检测的全面开展，大家对荧光定量 QPCR 的熟悉程度提高了不少，不过记得笔者还是刚读博进实验室的时候，被导师警告只能高年级师兄师姐通过申请才能做荧光定量这类实验， 实验室小伙伴们对荧光定量的印象，首先是：技术先进，总是和好文章相关；其次是：贵，仪器贵，试剂贵，和神秘，看得见，却摸不着，能发好文章，却被限制使用，荧光定量实在藏着太多的秘密！荧光定量到底是什么样的实验？技术诞生二十多年了，为什么价格还那么高？

秘密一. qPCR 的本质其实是，普通 PCR + 光学监控系统

qPCR 技术原理：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。qPCR 本质上是普通 PCR 加上一套光学观察系统，普通 PCR 类似电影剧终时的一张照片（PCR 扩增结果），qPCR 则是完整的全部电影（PCR 的全过程）。不同的检测目的，需要不同的荧光定量 PCR 仪器及与之对应的 qPCR mix。qPCRmix 的类型大致可以分为以下几个类别。

秘密二. 荧光定量 PCR 只能使用厂家配套试剂和耗材吗？

荧光定量 PCR 的神秘感，完全是人为因素造成的！
 
A、导师说：仪器贵啊，不要随便动 qPCR 仪器！首先，qPCR 仪价格昂贵，动辄几十万一台！很多实验室都会叮嘱学生不要乱动 qPCR 仪器，甚至有些实验室会把仪器锁上，只有高年级的师兄师姐通过多次申请，才能使用！低年级学生只能在旁边观看学习。其次，有些实验室经费紧张，没有 qPCR 仪器，只有特别重要的实验，才申请使用公用 qPCR 仪器进行实验！再次，qPCR 实验一般需要先提取RNA和反转录实验，试剂成本高、实验难度大！qPCR 在实验室愈显「高端」「上流」，锁在房间里的 qPCR 仪器更显神秘！此外，由于仪器的不同，有些会用到 ROX 染料修正定量 PCR 仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，而有些不用，客户便会很困惑（其实这个就是根据仪器选择对应的试剂，下文会介绍）。
 
B、进口品牌仪器厂商说：我们的仪器和试剂必须配套，效果才能最好！

实验室在最初花费大额经费购买 PCR 仪器时，也被强制性的购买了配套的试剂。「我们的仪器必须和我们的试剂配套！」「原配的试剂效果稳定，使用其他的试剂了问题，我们不负责！」。昂贵的仪器已经买了，试剂贵点也算合理吧!当实验室测试成功，「测试成功后就别折腾了，好不容易稳定的体系。」实验室老师如是说。
 
C、进口品牌代理商说：进口稳定靠谱，国产的不行

国内被高度垄断的 qPCR 市场，进口品牌拥有无与比拟的话语权。十多年来，客户使用进口的仪器和试剂，接受指导进口品牌的技术指导，看的是进口品牌代理商的广告，也就习惯了高价：这个实验本身就这么贵！国内厂商突破层层技术封锁，在 qPCR 上技术终于成熟，而价格却只有进口的几分之一，兴冲冲的拿到市场。而市场（进口品牌代理商）却说：进口稳定靠谱，国产的不行，不知道什么时候就会出问题！

qPCR 技术已经诞生二十多年，国内的 qPCR 仪器和试剂技术早已成熟，市面上简单快速的 RNA 提取试剂盒和一管化反转录试剂盒的开发， qPCR 实验已不显那么昂贵和困难！qPCR 实验的迷雾已经吹开，被锁住的实验需要放开了！
 
当国内没有 qPCR 技术时，进口厂商拥有定价权，我们只能硬着头皮接受。经多年的研发和多年的市场检验，qPCR 技术国内已经成熟。仪器和试剂必须配套?对于一种通用常见的实验，这简直是个笑话，针对仪器开发试剂也并不是很难的事情。技术已经成熟，进口品牌十几年的超额利润时间，该结束了！原配试剂太贵了，而且也不一定好！荧光定量试剂的真实价格，该显现了!

秘密三：荧光定量试剂和成分价格揭秘！

qPCR 实验部分和普通 PCR 的实验并没有多少差别，但价格怎么差那么多呢？上图荧光定量试剂成本并没有给出答案。这个试剂贵的不是成本，而是技术壁垒和市场话语权。
国内荧光定量技术已经成熟，进口品牌十几年的超额利润时间，该结束了！

经多年科研攻关，终于突破国外厂商的专利封锁，上海易英生物研制的 RTqPCR 解决方案试剂盒系列，具有超快速度，高特异性，高灵敏度，重复性好，定量准确，全封闭化反应杜绝污染等优点。聚合美进场，让荧光定量试剂不再那么昂贵，已经为复旦，浙大，中科院等单位很多实验室节约大量经费，受到客户的热烈欢迎！
 

RTqPCR 解决方案试剂盒系列

一. 磁珠法 RNA 提取

磁力架适配 货号 Cat. EP088-96
目前磁珠法 RNA 提取没有任何一家国内厂商能有技术，进口推荐 Thermo 两种货号的磁珠法 Mag max RNA 提取试剂盒。

1. Cat. AM1830   MagMAX™-96 Total RNA Kit   96 次 5007 元
2. Cat. A27828    MagMAX™ mirVana™ Total RNA Kit 96 次 4868 元

配合 Easyinno 快速磁分离 Cat. EP088-96 96 孔磁力架使用体验佳

二. CDNA 逆转录

货号 Cat. ERT05 ,  600ul ，3 微升 RNA 体系  200RXN   5985 元 Easyinno cDNA 合成预混液(2X)，预混液：RNA 1:1 致简混合，方便体验本产品可以 mRNA 或者总 RNA 为模板，高效合成第一链 cDNA。本制品含有反转录反应所需的全部试剂（BalbScript Reverse Transcriptase，RNase Inhibitor，Oligo(dT)18，Random N6，dNTPs），浓度为 2×。反应时只需要加入 RNA 模板和水即可，操作简单，减少操作过程中的污染。合成的第一链 cDNA 可直接用于 PCR 或荧光定量 PCR 的模板，第二链 cDNA 的合成或线性 RNA 扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链 cDNA 的实验。
保存温度：-20℃

产品特点：
本制品中使用的 Reverse Transcriptase 无 RNase H 活性，可避免第一链 cDNA 合成过程中，RNA/DNA 杂交模板链中 RNA 降解，保证了 cDNA 合成质量。本制品中 Random N6 和 Oligo(dT)18 引物比例经过优化，可均匀合成样品中的 cDNA。操作简单，只需要加入 RNA 模板即可完成反应体系配制，降低了操作过程中的污染机会。

注意事项：
用 DEPC 处理实验用到的所有实验器材，或购买已经证明无核酸酶的实验
用具，实验过程戴手套并经常更换手套，避免 RNA 酶的污染。

三. QPCR Taqman 探针及引物预混液定制

货号 Cat. ERT06 , 300ul，20ul 反应体系  300RXN 反应  FAM 标记  2950元
预混液为 20X 体系， 20ul 反应体系内只需加1ul.
货号 Cat. ERT07 , 300ul，20ul 反应体系  300RXN 反应  NED 标记  3650元
预混液为20X体系， 20ul 反应体系内只需加1ul.
货号 Cat. ERT08 , 300ul,，20ul 反应体系  300RXN 反应  VIC 标记  3650元
预混液为 20X 体系， 20ul 反应体系内只需加 1ul.

四. QPCR Taqman 探针法快速启动 qPCR 预混液

货号 Cat. ERT09 ,  5ml ，20 微升反应体系  5000RXN 反应   2980 元
预混液：CDNA 稀释液 1:1 致简混合  （含所有包括 ROX 在内必需试剂）

本品是专用于探针法 (TaqMan，Molecular Beacon 等) 实时荧光定量 PCR 的预混体系，浓度为 2×，包含 Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+ 等，操作简单方便。主要用于基因组 DNA 靶序列和 RNA 反转录后的 cDNA 靶序列检测。本品含有的 Fast Taq DNA Polymerase，能有效减少在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活仅需在 95℃ 孵育 30s。整个 PCR 反应过程比普通反应可节省约 40 分钟，大大缩短了 PCR 的反应时间。独特的 PCR 缓冲体系与快速热启动酶的组合，有效抑制了非特异产物的产生，并显著提高了 PCR 的扩增效率，荧光信号更强，灵敏度更高，线性范围更宽。该产品适用范围广，可用于普通和快速定量 PCR 程序。

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于 -20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在 2～8℃ 保存。

使用方法：
以下举例为常规 PCR 反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。PCR 反应体系如下：


点击查看： Easyinno 全新配套 QPCR 的磁珠法专利应用解决方案系列：